揭秘CST为什么会用non-phospho非磷酸化抗体来检测功能性蛋白

红肚兜

今天看到了一个关于磷酸化抗体的实验室小段子，大致是说，初入实验室时，以为研究蛋白的功能就是检测该蛋白的含量。后来知道了蛋白检测不简单，因为看到师兄、师姐还分开检测靶标的磷酸化、总蛋白水平。而当你检测磷酸化蛋白时，却发现CST实验室还检测起非磷酸化靶标！
　　
　　
　　
　　CST赛信通关于磷酸化抗体Autophagy Signaling信号通路图
　　
　　可能很多人都和我一样，不知道非磷酸化抗体和总蛋白也可以是一对CP。今天我就分享一个来自CST的知识点，以β-catenin为例，让你明白为什么CST会用non-phospho抗体来检测功能性蛋白。
　　
　　
　　
　　CST赛信通关于磷酸化抗体MAP Kinase Signaling信号通路图
　　
　　β-Catenin（β-链蛋白）是典型Wnt信号转导通路中的一个关键下游效应分子。在生理状态下,当Wnt信号缺失时（OFF-State），β-catenin作为细胞间黏附接头蛋白和转录共调节分子，与Axin、APC、GSK3β和CK1α形成多蛋白复合体，并被该复合体内的激酶磷酸化，CK1可在Ser45位点磷酸化β-Catenin，随后GSK-3β在Ser33、Ser37和Thr41位点磷酸化β-Catenin。紧接着，β-Catenin被β-TrCP/Skp通路泛素化后，最终被蛋白酶体降解。
　　
　　
　　
　　CST赛信通关于磷酸化抗体p53 Signaling信号通路图
　　
　　当Wnt配体存在时（ON-state），共同受体LRP5/6被带入复合体与Wnt结合的卷曲蛋白（Frizzled）一起。这样就导致蓬松蛋白(Dvl)相继磷酸化、多聚泛素化和聚合后被激活，并从APC/Axin上将GSK-3β取代。接着，稳定的β-catenin通过Rac1和其他因子转运入核，在胞核内结合LEF/TCF转录因子，启动Wnt/β-catenin靶向基因的表达。
　　
　　
　　
　　CST赛信通关于磷酸化抗体Phosphoinositide Signaling信号通路图
　　
　　总之，β-Catenin作为保守的Wnt/β-Catenin通路(OFF/ON-state)的重要因子，参与调控多种发育和稳态功能（细胞增殖、分化和命运抉择等），推动干细胞的多能性和自我更新。其还作为共激活因子，协助激活那些调控Wnt靶基因表达的TCF/LEF转录因子家族。
　　
　　正因为β-catenin的活性状态为其非磷酸状态，所以其检测也与一般蛋白不同。为观察β-Catenin的降解情况，CST中国（赛信通）的实验小伙伴分别将Phospho-β-Catenin(Ser33/37/Thr41)抗体(#9561)、Phospho-β-Catenin(Thr41/Ser45)抗体（#9565）与β-Catenin总蛋白抗体组成CP，进行蛋白检测。结果显示,经MDI处理后的各时间点，细胞中总的β-Catenin含量减少，另外，MDI处理24hr后，β-Catenin磷酸化水平升高，说明MDI处理后β-Catenin蛋白降解加剧。然后，，CST中国（赛信通）的实验小伙伴使用#8814检测non-phospho(Active)β-Catenin(Ser33/37/Thr41),有力地证明未被磷酸化、稳定、具有活性的β-catenin含量增加。由此可见，当要观察活性β-Catenin表达水平时，non-phos-β-catenin抗体和β-catenin总蛋白抗体就会成为一对CP喽。另外，由于稳定的β-catenin入核后参与靶基因的转录过程，CST中国（赛信通）的实验小伙伴为观察核内有活性的β-catenin水平，故使用#8814检测了核内non-phospho(Active)β-Catenin(Ser33/37/Thr41)，此时，它还与组蛋白组成CP了。CST中国（赛信通）的实验小伙伴还发现，同样与发育相关的YAP靶点，也有类似情况。YAP被广泛认为是Hippo通路的一个中央介导物，从而在组织生长和器官大小的调节中发挥功能性和广泛保守的作用。但是LATS激酶磷酸化YAP许多位点（如Ser127和Ser397），从而导致诱发YAP蛋白酶体降解。如果要检测细胞中具有活性水平的YAP，也需要检测non-YAP(Ser127和Ser397)。
　　
　　
　　
　　CST赛信通关于磷酸化抗体Warburg Effect信号通路图
　　
　　作为我心中的抗体领导者，最后再给大家安利下CST这家公司吧。CST（Cell Signaling Technology ) 是一家由科学家创立的私营家族公司，CST中国（赛信通）是CST在中国建立的独资子公司，致力于提供全球最高品质的创新研究和诊断产品，加速生物学认知以及实现个体化医疗。董增军（Jay Dong）为赛信通CST（全球）副总裁兼亚太总经理。今年是CST成立20周年，CST中国（赛信通）成立11周年，期待他们能有更多的研究成果和诊断产品问世~